Bakteriofágy jako perspektivní nástroj v ochraně rostlin proti bakteriím rodu Xanthomonas

28. 10. 2024 Ing. Mária Neoralová, Mgr. Markéta Michutová; Mendelova univerzita v Brně Choroby Zobrazeno 757x

Bakterie patří k mikroorganismům, které způsobují závažné choroby rostlin. Jsou obávanými patogeny z důvodu velmi omezených možností ochrany. Použití antibiotik je v produkčním zemědělství nemožné, k chemické ochraně se používají účinné látky na bázi mědi, baktericidní účinek má i stříbro. Výzkumníci tak hledají další efektivní možnosti z hlediska účinnosti a bezpečnosti pro člověka, necílové organismy a prostředí. Perspektivní z tohoto pohledu se jeví bakteriofágy, o nichž pojednává tento článek vycházející z výzkumu prováděného při řešení disertační práce M. Neoralové.

Označení bakteriofág pochází z řeckého „požírající bakterie“. Jde o viry infikující bakterie (d'Herelle 1926). Viry jsou nejpočetnější skupinou mikroorganismů na světě. Ve vzorcích vody bylo nalezeno 2,5×10⁸ virů (Bergh et al. 1989) a v půdě 10⁸–10⁹ virů/g suché hmoty, přičemž nejvíce jich je ve vlhčích lesních půdách a nižší v intenzivně obhospodařované půdě (Williamson et al. 2005).

Historie výzkumu bakteriofágů

Objevitelem je britský bakteriolog Frederic W. Twort, jenž působil na Brownově Institutu v Londýně. V roce 1915 objevil organismus, který infikuje a zabíjí bakterie. Nedokázal ovšem přesně určit příčinu smrti bakterií. Domníval se, že se jedná o fázi životního cyklu bakterie, popřípadě účinek enzymu produkovaný samotnou bakterií nebo virem, který je schopný bakterii zničit (Twort 1917). Jeho výzkum ovšem přerušila prví světová válka a následovný objev antibiotik.

Nezávisle na něm francouzsko-kanadský mikrobiolog Felix d’Herelle, z Institutu L. Pateura v Paříži, v roce 1917 objevil „neviditelného makrobiotického antagonistu“ proti bakterii rodu Shigella, působící dyzentérii. Jako první si uvědomil, že jde o virus parazitující na bakterii a pojmenoval ho bakteriofág (zkráceně fág, jak bude nazýván i dále v tomto článku). Během svého dalšího výzkumu představil úspěšný koncept fágové terapie v klinických testech (d'Herelle 1917, 1926).

Důležitým milníkem ve výzkumu bakteriofágů bylo založení Eliavova ústavu bakteriofágů, mikrobiologie a virologie (IBMV) v Tbilisi, který v roku 1923 vznikl společným úsilím gruzínského mikrobiologa George Eliavu a Felixe d'Herelleho. Bohužel i přes jeho přínos pro veřejné zdraví byl Eliavu roku 1937 označen sovětským režimem za nepřítele lidu a byl popraven. Ani d'Herelle se do Gruzie už nikdy nevrátil. Institut, který existuje dodnes se zaměřuje na fágovou terapii (Chanishvili 2012).

První „zlatý věk“ výzkumu bakteriofágů byl od 30. do 70. let 20. století a vedl k významným objevům, jako je identifikace DNA, rozluštění genetického kódu a objevení messengerové RNA. Tyto přelomové objevy daly základ vzniku nové vědy  - molekulární biologii (Stent et al. 1966). V roce 1969 získali Max Delbrück, Alfred Hershey a Salvador Luria Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu za objev replikace virů a za popis jejich genetické struktury (Kurtböke 2012).

Zájem o výzkum bakteriofágů opět stoupl v letech 1980–1990, kdy došlo k objevu rekombinantních DNA technik, kde se využívají bakteriofágy jako primární vektory (Brosius 1988), a byl zaznamenán obrovský pokrok v molekulární genetice.

Klasifikace a dělení podle morfologie

Všechny organismy na světě jsou nějakým způsobem vědecky klasifikovány a zařazeny do systému. Nejinak je tomu u bakteriofágů. Taxonomií se zabývá International Committe on the Taxonomy of Viruses (ICTV; www.ictv.global).

Aktuálně je známo nejméně 11 morfologicky odlišných čeledí bakteriofágů (Abedon 2022), které se rozlišují podle struktury a velkosti genomů (Abedon 2009; Abedon 2022; Hyman and Abedon 2012b). Viriony bakteriofágů mají obvykle ikosaedrický tvar. Podle přítomnosti bičíku rozlišujeme tři třídy - Podoviridae s krátkými bičíky, Siphoviridae s dlouhými, nekontraktilními bičíky a Myoviridae s dlouhými kontraktilními bičíky. K formám virionů bez bičíku jsou zařazeny vláknité bakteriofágy z čeledi Inoviridae, sférické z čeledi Cystoviridae a pleomorfní Plasmaviridae. Ostatní fágy sice mají ikosahedrickou strukturu a v mnoha případech připomínají hlavičku bičíkatých fágů, ale nemají bičík (Abedon 2022).

Historie fágové terapie u rostlin

Bakteriofágy byly poprvé použity proti fytopatogenní bakterii v roce 1924, kdy vědci Mallman a Hemstreet zjistili, že přefiltrovaná tekutina z dekompostované kapusty inhibuje růst bakteriálních kultur Xanthomonas campestris pv. campestris (Mallmann a Hemstreet 1924). První polní pokusy se uskutečnily proti chorobě způsobené rostlinným patogenem Pantoea stewartii. Semena kukuřice infikovaná P. stewartii byla namáčena ve fágovém preparátu izolovaném z odumřelých rostlin kukuřice. Rostliny vypěstované ze semen ošetřených fágovým filtrátem vykazovaly významné snížení výskytu choroby (Thomas 1935).

Fágová terapie je v současnosti považována za bezpečnou a všestrannou alternativu k antibiotikům, zejména pokud je použití antibiotik buď neúčinné v případě multirezistentních bakterií, nebo zakázané, jako například v rostlinné výrobě (Holtappels et al. 2021; Melo et al. 2020). V posledních letech bylo vyvinuto několik fágových preparátů určených k biologické ochraně rostlin, které byly testovány v laboratorních podmínkách, ve sklenících a kontrolovaných polních podmínkách. Pro úspěšnou aplikaci biologické ochrany je rozhodující důkladně charakterizovat fágy, které se mají aplikovat, na genomické úrovni, a také zohlednit jejich interakce s patogenem, který má být ošetřen, aby se předešlo selhání v důsledku získání rezistence nebo nevhodného hostitelského rozsahu. Problémem by mohl být příliš úzký nebo příliš široký hostitelský rozsah (Clavijo-Coppens et al. 2022).

Zohledňuje se při tom i nechtěný přenos původců chorob fágovými vektory, kde jen několik studií naznačuje přítomnost a přenos fágů hmyzími vektory, kteří jsou zodpovědní za šíření chorob, jako je například Pierceova choroba nebo spála (Bhowmick et al. 2016; Clavijo-Coppens et al. 2021; Woods et al. 1981).

Bakteriofágy rodu Xanthomonas v ochraně rostlin

Do dnešní doby bylo zdokumentováno několik dalších případů detekovaných bakteriofágů bakterie rodu Xanthomonas, které vykazovaly vlastnosti vhodné pro použití na kontrolu rostlinných patogenů.

U rodu Prunus je to bakteriální skvrnitost způsobena X. arboricola pv. pruni (Civerolo a Keil 1969; Saccardi et al. 1993). Aplikací fágů na broskvoně demonstroval jejich účinnost Saccardi a jeho kolegové, když listy infikované X. campestris pv. pruni postříkané jedním F8-fágem vykazovaly méně symptomů než neošetřené listy (Saccardi, Gambin, Zaccardelli, Barone a Mazzucchi 1993). Na druhé straně během dalších pokusů s rostlinami ve sklenících se po ošetření koktejlem fágů proti X. campestris pv. juglandis neprokázal žádný účinek na ochranu ořechů před bakteriální spálou (McNeil et al. 2001).

Rakovina citrusů způsobená X. citri subsp. citri a citrusová skvrnitost způsobená X. fuscans subsp. citrumelonis (Balogh et al. 2008). Účinnost biologické kontroly na bázi fágů se testovala na grapefruitech proti X. citri pv. citri, který je uveden jako karanténní škůdce (seznam EPPO A1 2020), a X. axonopodis pv. citri ve skleníkových a školkařských podmínkách.

Samostatná aplikace fága φXaacA1 neměla žádný účinek. Účinnost fágového koktejlu se následně zlepšila přidáním rostlinných induktorů systémové získané rezistence (SAR) k fágovým přípravkům. V polních podmínkách se výskyt patogena na citrusových rostlinách infikovaných X. citri pv. citri snížil o 50 % při použití induktorů SAR a o 84 % při použití induktorů SAR a fágově-ochranných přípravků (Ibrahim et al. 2017).

Ve skleníkových podmínkách Balogh a kol. dosáhli dobré účinnosti na citrusových rostlinách infikovaných X. axonopodis pv. citrumelo zlepšením perzistence fágů na listech postříkaných koktejlem tří fágů doplněným jen ochrannými přípravky. Navíc fágový koktejl doplněný o komplex měď-mancozeb snižuje 83 % bakteriálních skvrn způsobených X. axonopodis pv. citrumelo ve srovnání s neošetřenými rostlinami (Balogh, Canteros, Stall a Jones 2008). Všechny tyto výsledky naznačují, že pro zlepšení účinnosti fágů, zejména na stromech, je nutné přizpůsobit formulaci fágů každému patosystému.

Na druhou stranu, na kontrolu Xanthomonas spp. na jednoletých plodinách, se ve skleníkových nebo polních podmínkách projevila slibná účinnost pouze v několika případech. Komerční fágový přípravek Agriphage od společnosti OmniLytix, doplněný o fágově-ochranné přípravky, snížil závažnost skvrnitosti listů cibule a skvrnitosti listů rajčat způsobených X. axonopodis pv. allii a X. campestris pv. vesicatoria. Několik předchozích studií potvrdilo, že přípravky na bázi fágů jsou při potlačování a snižování závažnosti onemocnění účinnější než ošetření mědí (Balogh et al. 2003; Flaherty et al. 2000; Lang et al. 2007; Obradovic et al. 2004). Kromě toho aplikace fágů na infikované rostliny zvýšila přírůstek hmotnosti extra velkých plodů u rajčat ve srovnání s měďnatými baktericidy (Balogh et al. 2018; Flaherty, Jones, Harbaugh, Somodi a Jackson 2000).

V případě fágové ochrany proti X. oryzae pv. oryzae bylo izolováno široké spektrum fágů (Chae et al. 2014). Chae a jeho kolegové prokázali, že formulované koktaily fágů snižují výskyt patogena na zralých rostlinách rýže. Výsledky naznačují, že použití fágových přípravků na rýži je vhodné ke kontrole patogenních bakterií po celou dobu vegetace rostliny (Adachi et al. 2012; Chae, Hung, Yu, Lee a Lee 2014; Clavijo-Coppens, Torres-Barcelo, Ansaldi, Taveau a Costechareyre 2022; Nakayinga et al. 2021).

Legislativa

Bakteriofágy používané v zemědělství ve Spojených státech a Kanadě mají status obecně uznávaných bezpečných látek (GRAS) a jejich regulace spadá pod Úřad pro potraviny a léčiva (FDA). Používání fágových přípravků bylo schváleno také v Izraeli, Kanadě, Švýcarsku, Austrálii a na Novém Zélandu (Zimmermann et al. 2018a).

V EU patří fágy do regulační kategorie mikrobiálních přípravků na ochranu rostlin (PPP = Plant Protection Products), která zahrnuje bakterie, houby a viry. Před registrací a povolením uvedení na trh musí PPP projít důkladným posouzením rizika podle nařízení (ES) č. 1107/2009. Takovým schválením prošla např. entomofágní bakterie Bacillus thuringiensis.

V případě fágových přípravků pro biologickou kontrolu v Evropě je regulační proces stejný jako pro konvenční přípravky na ochranu plodin. Postup podávání žádostí vyžaduje sestavení kompletní hodnotící dokumentace finalizovaného výrobku, kterou hodnotí úřad EFSA a která zahrnuje fyzikální a chemické analýzy, hodnocení účinnosti, toxicity a ekotoxikologie. K dnešnímu dni nebyl v EU povolen žádný koktejl bakteriofágů jako PPP, který by neposkytoval účinné řešení biologické kontroly rostlinných patogenních bakterií.

Hlavním problémem biologické ochrany prostřednictvím fágů je, že koktejly bakteriofágů musí být pravidelně aktualizovány, aby byly účinné proti novým vznikajícím bakteriálním kmenům, a každá změna jedné ze složek PPP vyžaduje opětovnou registraci. Povzbuzující je, že FDA a USDA začaly povolovat takové aktualizace některých komerčních fágových přípravků bez nutnosti absolvovat celý regulační schvalovací proces při každé aktualizaci (Vikram et al. 2021).

Společnost OmniLytics, jako součást společnosti Phagelux, vyvinula čtyři různé komerční produkty v rámci své produktové řady Agriphage ve Spojených státech, které byly registrovány jako biopesticidy agenturou US Environmental Protection Agency a jsou komercializovány společností Certis, USA. Jedná se o produkty AgriPhage™ (XCV & PST), AgriPhage-CMM, AgriPhage-Fire Blight, AgriPhage-Citrus Canker.

V Evropě jsou, i navzdory omezením na trhu k dispozici produkty na bázi bakteriofágů. Jedná se o produkty pro posběrové ošetření brambor od skotské společnosti APS Biocontrol, registrované jako pomocná látka pro zpracování pod názvem Biolyse^®-PB. Kromě toho maďarská společnost Enviroinvest byla oprávněna lokálně prodávat fágový koktejl Erwiphage PLUS účinný proti Erwinia amylovora podle přísných předpisů během jara 2020 (Clavijo-Coppens, Torres-Barcelo, Ansaldi, Taveau a Costechareyre 2022).

Jaká bude budoucnost ochrany rostlin pomocí fágů ukáže čas. Nicméně v době, kdy je větší a větší tlak na omezení používání (radikálně až nepoužívání) syntetických přípravků na ochranu rostlin se jeví využití bakteriofágů jako velmi perspektivní.

Obr. 1: Petriho miska, kde na souvislém bakteriálním povrchu byly lytickou aktivitou bakteriofága vytvořeny plaky o průměru 2 mm

Obr. 2: Snímek lytického bakteriofága vyhotovený pomocí elektronového mikroskopu

Seznam použité literatury je k dispozici u autorů.