Monitoring citlivosti Botrytis cinerea k fungicidům používaným k ochraně jahodníku

31. 07. 2022 Ing. Pavlína Jaklová, Ph.D., Mgr. Michaela Kracíková, RNDr. Petra Lišková, Ph.D.; Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o. Choroby Zobrazeno 1350x

Stanovení potenciálu vzniku a vývoje rezistence u patogenů, její monitoring a doporučení jak jí předcházet, je jedním ze základních podmínek pro využívání fungicidů v praxi. Tam, kde není monitoring rezistence běžnou praxí, je rezistence poprvé zaznamenána, až když pěstitelé zpozorují významné selhání účinnosti dříve účinných přípravků. Poté se musí rezistence odebraných vzorků patogenu potvrdit za kontrolovaných podmínek v laboratoři.

Toto potvrzení je důležité, protože existuje mnoho důvodů, proč se dříve účinné látky staly neúčinnými, např. intenzivní infekční tlak onemocnění, neúplné pokrytí rostlin fungicidem, nepřesné dávkování nebo načasování aplikace atd. (Anonym 1, 2022). Organizace FRAC (Fungicide Resistance Action Committee) vydává opatření a pokyny ke snížení rizika výskytu a vývoje rezistence vůči fungicidům, které představují komplexní postupy pro prodloužení účinnosti „rizikových“ skupin fungicidů a omezují tak ztráty způsobené rezistencí. Podrobnosti a doporučené metody jsou zveřejněny na webových stránkách organizace FRAC www.frac.info.

Citlivost B. cinerea v zemích EU

U přípravků ze skupiny anilinopyrimidinů (pyrimethanil, cyprodinil) byl proveden monitoring citlivosti B. cinerea ve vybraných zemí EU v produkčních a experimentálních výsadbách jahodníku. Dle výsledků FRAC byla frekvence výskytu rezistentních kmenů B. cinerea nízká, ve srovnání s posledními 10 lety je stabilní a kolísá v závislosti na lokalitě výsadby od nulových hodnot až po vysoké. Pokud jsou anilinopyrimidinové fungicidy aplikovány dle zásad antirezistentní strategie, stále si udržují relativně dobrou účinnost (Anonym 2, 2022).

Monitoring provedený k přípravkům ze skupiny QoI fungicidů (azoxystrobin, pyraclostrobin, trifloxystrobin) ukázal vysoký výskyt rezistentních kmenů B. cinerea v Německu, Polsku a Velké Británii. Střední úroveň rezistence byla zaznamenána v Dánsku a ve Francii (Anonym 3, 2022).

Ve světě byla zaznamenána selekce kmenů B. cinerea se sníženou citlivostí ke klíčovým fungicidům ze skupiny SDHI (boscalid, fluopyram). V zemích EU byla zaznamenána různorodá úroveň rezistence, od nízké až po střední úroveň. Pokud jsou při aplikaci SDHI fungicidů dodržovány doporučené antirezistentní strategie, dosahovaná účinnost těchto přípravků je uspokojivá (Anonym 4, 2022).

Graf 1: Růst klíčního vlákna (%) u jednotlivých koncentrací účinné látky fenhexamid (ppm) a testovaných izolátů

Graf 2: Relativní klíčivost spor B. cinerea (%) u jednotlivých koncentrací účinné látky boscalid (ppm) u vybraných reprezentativních testovaných izolátů

Graf 3: Relativní klíčivost spor B. cinerea (%) u jednotlivých koncentrací účinné látky pyraclostrobin (ppm) u vybraných reprezentativních testovaných izolátů

Testování citlivosti B. cinerea u nás

Pomocí laboratorní metody dle Weber a Hahn (2011) byla ve VŠÚO testována citlivost izolátů B. cinerea k účinné látce fenhexamid, kdy byl testován komerční fungicid Teldor 500 SC (Bayer AG; fenhexamid 500 g/l; jahodník: plíseň šedá; OL = 3 dny, dávka 1,5 l/ha), nikoliv pouze účinná látka. Tento přípravek je klíčovým fungicidem v ochraně jahodníku před napadením plodů B. cinera a jeho používání je mezi pěstiteli velmi rozšířeno. Na základě získaných dat byla vypočtena hodnota EC₅₀ (efektivní koncentrace fungicidu inhibujícího růst klíčního vlákna z 50 %) pomocí regresní analýzy procenta inhibice délky klíčního vlákna (% v kontrole) oproti log₁₀ koncentrace fungicidu. Dále byl k jednotlivým izolátům přidělen faktor rezistence (RF).

Faktor rezistence (tab. 1) každého izolátu k fungicidu byl vypočten jako EC₅₀ testovaný izolát / průměrné EC₅₀ skupiny nejvíce citlivých izolátů získaných v průběhu studie. Skupina nejvíce citlivých izolátů byla brána jako ekvivalent „baseline“ profilu pro srovnání posunu „shiftu“ v citlivosti houby k fungicidu. Průměrná hodnota EC₅₀ nejvíce citlivých izolátů (n = 10) byla 0,353 ppm. Z 12 sledovaných lokalit byly izoláty ze dvou lokalit označeny jako vysoce rezistentní vůči přípravku Teldor 500 SC, tj. vůči účinné láce fenhexamid. Izoláty B. cinerea z pěti produkčních výsadeb a jedné domácí zahrady vykazovaly střední rezistenci vůči účinné látce fenhexamid. Izoláty B. cinerea získané ze třech lokalit lze označit jako citlivé (tab. 2).

Z grafu 1 vyplývá, že při koncentraci fenhexamidu 0,01 ppm nebyl omezen růst klíčního vlákna u většiny izolátů B. cinerea. Jako hraniční, tzv. diskriminační koncentrace se ukázala koncentrace fenhexamidu 0,1 ppm, při níž spory klíčily, ale růst mycelia byl inhibován. Při koncentracích 1, 10 a 100 ppm spory převážně vyklíčily, avšak další růst byl ihned po vyklíčení zastaven. U některých izolátů však nebyla prokázána inhibice růstu ani při koncentraci 100 ppm, což prokázalo, že tyto izoláty B. cinerea lze považovat za vysoce rezistentní vůči účinné látce fenhexamid (obr. 1).

Dále pomocí validované laboratorní metody dle FRAC (Stammler a Speakman, 2006) bylo provedeno testování citlivosti B. cinerea v mikrotitračních destičkách s využitím čistých účinných látek ze skupiny SDHI fungicidů - boscalid a QoI fungicidů - pyraclostrobin. Účinné látky boscalid a pyraclostrobin jsou součástí komerčního fungicidu Signum (BASF SE; boscalid; 267 g/kg; pyraclostrobin; 67 g/kg; jahodník: plíseň šedá; OL = 7 dní; dávka 1,8 kg/ha). Tento přípravek je rovněž klíčovým fungicidem k ochraně jahodníku před napadením plodů B. cinera a jeho používání je mezi pěstiteli široce rozšířeno. Riziko selekce rezistentních kmenů patogenu vůči SDHI fungicidům je střední až vysoké a vůči QoI fungicidům je vysoké, proto je doporučováno striktní dodržování zásad antirezistentní strategie.

V experimentech byla měřena optická denzita ve spektrofotometru, která byla v pokusných zkumavkách srovnána s optickou denzitou sterilní negativní kontroly a byla vynesena jako relativní nárůst mycelia (%, grafy 2 a 3). Nárůst je srovnáván s negativní kontrolou (suspenze konidií bez účinné látky), kdy hodnota EC₅₀ (ppm) je koncentrace účinné látky, při které je růst izolátu inhibován z 50 % vzhledem k neošetřené kontrole.

Hodnoty EC₅₀ (ppm) izolátů B. cinerea z produkčních výsadeb jsou porovnávány hodnotami EC₅₀ (ppm) citlivých izolátů. U 4 izolátů pocházejících z okresů Mělník, Nymburk, Kolín byla zaznamenána vysoce rezistentní reakce vůči působení účinné látky boscalid. Ve stejných lokalitách byly současně zachyceny i izoláty se sníženou citlivostí (střední rezistence) i izoláty citlivé k působení této účinné látky. Tři izoláty ze stejných lokalit byly rezistentní vůči účinné látce pyraclostrobin. Z těchto lokalit pocházejí také izoláty citlivé k pyraclostrobinu.

Tab. 1: Kategorie faktoru rezistence (RF)

Tab. 2: Přehled získaných izolátů B. cinerea z jednotlivých lokalit na území ČR

Tab. 3: Přehled izolátů B. cinerea z jednotlivých lokalit na území ČR a stanovená EC₅₀ (ppm) pro boscalid; citlivost izolátů je barevně rozlišena: zelená - citlivý, oranžová - snížená citlivost, červená - rezistence

Tab. 4: Přehled izolátů B. cinerea z jednotlivých lokalit na území ČR a stanovená EC₅₀ (ppm) pro pyraclostrobin; citlivost izolátů je barevně rozlišena: zelená - citlivý, červená - rezistence

Obr. 1: Klíčení konidií Botrytis cinerea v daných koncentracích účinné látky fenhexamid

Literatura je k dispozici u autorek.

Literatura:
Anonym 1. 2022. Resistance overview. Fungicide action committee. 2020. Dostupné z http://www.frac.info/resistance-overview.
Anonym 2, 2022.Protocol of the discussions and use recommendations of the AP’s Working Group of the Fungicide Resistance Action Committee (FRAC). Dostupné z https://www.frac.info/docs/default-source/working-groups/ap-fungicides/ap-wg/minutes-of-the-2020-ap-meeting-recommendations-for-2020.pdf?sfvrsn=9215499a_2.
Anonym 3, 2022. Protocol of the discussions and use recommendations of the QoI Working Group of the Fungicide Resistance Action Committee (FRAC). Dostupné z https://www.frac.info/docs/default-source/working-groups/qol-fungicides/qoi-meeting-minutes/minutes-of-the-2020-qoi-wg-meeting-and-recommendations-for-2020-(june-2020-update).pdf?sfvrsn=f2a4499a_2.
Anonym 4, 2022. Protocol of the discussions and use recommendations of the SDHI Working Group of the Fungicide Resistance Action Committee (FRAC). Dostupné z https://www.frac.info/docs/default-source/working-groups/sdhi-fungicides/sdhi-meeting-minutes/minutes-of-the-2020-sdhi-meeting-21-22th-of-january-2020-with-recommendations-for-2020.pdf?sfvrsn=5918499a_2.
Stammler, G., Speakman, J., 2006. Microtiter method to test the sensitivity of Botrytis cinerea to boscalid. Journal of Phytopathology 154:508–510.
Weber, W. S., Hahn, M., 2011. A rapid and simple method for determining fungicide resistance in Botrytis. Journal of Plant Diseases and Protection, 118 (1):17–25.