Účinnost vybraných rostlinných silic proti bakterii Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum

03. 01. 2025 Ing. Barbora Jílková, Ph.D. a kol. Choroby Zobrazeno 306x

Jedním z původců bakteriální měkké hniloby hlíz bramboru je pektinolytická bakterie Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc). Onemocnění významně redukuje výnos, zhoršuje se kvalita a skladovatelnost hlíz bramboru. Hniloba se může projevit již v půdě, krátce po sklizni, nebo až v průběhu skladování (Vokál, 2013).

Bakterie přežívají a šíří se napadenou nebo kontaminovanou sadbou, proto je proti bakteriálním patogenům velmi důležitá ochrana hlíz mořením. V současné době jsou však k moření hlíz proti bakteriálním patogenům povoleny pouze měďnaté přípravky, chitosan a chitosan hydrochlorid. Z toho důvodu se zaměřuje pozornost na studium antagonistické aktivity bakteriálních a houbových organismů (Abd‑El‑Khair a kol., 2021) nebo na využití rostlinných silic či jejich jednotlivých purifikovaných složek (Hajian-Maleki a kol., 2021).

Jako perspektivní pro moření hlíz bramboru se jeví silice ze skořicovníku, která má silný baktericidní účinek (Božik a kol., 2017b; Bravo Cadena a kol., 2018) a její hlavní složkou je z 63 % cinnamaldehyd. Také silice z dobromysli obecné má dobré antimikrobiální účinky, hojně je využívána v lidovém léčitelství a gastronomii. V silici z dobromysli jsou nejvíce obsaženy thymol 27 % (Bakkali a kol., 2007) a carvacrol v rozmezí 30–67 % (Bakkali a kol., 2007; Božik a kol., 2017a). Silice z máty peprné má rovněž antiseptické a antimikrobiální vlastnosti, hojně se využívá v potravinářském, farmaceutickém i kosmetickém průmyslu. Hlavní složkou je ze 63 % menthon (Sharifi-Rad, 2017).

Cílem naší studie bylo v laboratorních podmínkách in vitro stanovit minimální inhibiční koncentraci vybraných silic (dobromysli obecné, máty peprné a skořicovníku čínského) a následně in vivo vyhodnotit vhodné způsoby ošetření (moření) hlíz bramboru.

Pokusy

Bakteriální kultura

Bakteriální kmen CPPB 56 (VÚRV Praha-Ruzyně) pektinolytické bakterie Pcc byl kultivován na King B médiu (HiMedia Lab., Indie) 48 h při optimální teplotě pro růst bakterie 28 °C. Do všech testů byla připravena bakteriální suspenze o koncentraci 1×10⁸ CFU/ml, což odpovídá 0,5 McFarlandovy zákalové stupnice. Stanovení bylo provedeno pomocí denzitometru DEN-1 (BIOSAN).

Testované odrůdy

Do testování byly zařazeny dvě odrůdy brambor Red Anna (Vesa Velhartice a.s.; Ovo-Sadba s.r.o.) a Antonia (Ovo-Sadba s.r.o.). Red Anna je poloraná červenoslupká odrůda varného typu AB, s vysokým výnosem hlíz. U této odrůdy byla prokázána citlivost k pektinolytickým bakteriím (Kmoch a kol., 2022). Antonia je poloraná salátová odrůda se žlutou slupkou varného typu AA.

Minimální inhibiční koncentrace (MIC)

Metodika byla převzata od Hajian-Maleki a kol. (2021) a EUCAST (2003) a modifikována dle testovaných podmínek. Bakteriální suspenze byla připravena v Mueller Hinton Broth (MHB) (HiMedia Lab., Indie).

Silice byly ředěny v koncentrační řadě (100; 75; 50; 25; 10; 5; 3; 2,5; 1,5; 0,5 μl/ml) a jejich roztoky byly připraveny 1,1× koncentrovanější z důvodu přidání bakteriálního inokula. Koncentrace 100 μl/ml byla ředěna 96% ethanolem a pro lepší homogenitu bylo přidáno několika kapek Tween 20 (0,01% [w/v]) (Merck KGaA, Německo). Tato koncentrace sloužila také jako základní roztok. K ředění následných koncentrací ze základního roztoku byl použit MHB s přidáním několika kapek Tween 20. Připraveny byly také kontrolní varianty - kontrola bakteriálního inokula, kontrola čistoty MHB, kontrola čistoty silice v dané koncentraci. Vzhledem k těkavosti silic bylo zvoleno testování v 0,2ml mikrozkumavkách, do kterých bylo pipetováno 135 μl roztoku přírodní látky v daných koncentracích a 15 μl bakteriálního inokula. Destička s mikrozkumavkami byla zabalena do fólie a inkubována při optimální teplotě pro růst bakterie s nepřetržitým třepáním na třepačce při rychlosti 100 rpm.

Hodnocení MIC

Do jednotlivých vzorků bylo pipetováno 15 μl 0,01% roztoku barviva resazurinu (Merck KGaA, Německo), jehož změna zabarvení v roztoku sloužila jako indikátor živých bakteriálních buněk. Metodika byla částečně převzata od Mann a Markham (1998). Vzorky byly opět zabaleny do fólie a inkubovány další 2 h při optimální teplotě pro růst bakterie s nepřetržitým třepáním při rychlosti 120 rpm. Poté byly hodnoceny barevné změny vzorků oproti kontrolám. Fialové až růžové zbarvení testovaného vzorku znamenalo přítomnost živých bakterií, modré zbarvení znamenalo přítomnost mrtvých bakterií. Poslední koncentrace, u které bylo zjištěno modré zabarvení, byla hodnocena jako MIC.

Máčení

Na hlízách brambor odrůd Red Anna a Antonia bylo testováno preventivní a kurativní ošetření silicemi proti pektinolytickým bakteriím za pokojové teploty (22±2 °C) a předskladovací teploty (15 °C) po dobu 7 dnů v temné místnosti. Metodika byla částečně převzata od Hajian-Maleki a kol. (2021). Testy byly provedeny na 6 hlízách ve 2 opakováních, s kontrolou růstu inokula Pcc. Hlízy byly nejprve povrchově desinfikovány chlornanem sodným (NaOCl) a 2× důkladně opláchnuty destilovanou vodou.

Preventivní ošetření máčením - do hlíz byly udělány dva protilehlé vpichy o průměru 2 mm a hloubce 4 mm sterilní jehlou. Hlízy byly máčeny na 20 min v silici v dané minimální inhibiční koncentraci a poté se nechaly oschnout. Po oschnutí bylo do ran pipetováno 15 µl bakteriálního inokula. Hlízy byly umístěny do krabice, která byla uzavřena víkem, a inkubovány buď při pokojové teplotě, či teplotě předskladovací. Po 7 dnech byly hlízy podélně rozříznuty přes místa poranění a hnilobné plochy byly vyfotografovány. Vyhodnocení velikosti hnilobné plochy bylo provedeno pomocí obrazové analýzy programu Assess 2.0 (APS press, USA).

Kurativní ošetření máčením - do hlíz byly udělány dva protilehlé vpichy o průměru 2 mm a hloubce 4 mm sterilní jehlou. Do ran bylo pipetováno 15 µl bakteriálního inokula. Hlízy byly umístěny do plastové krabice s víkem a inkubovány 24 h za pokojové teploty. Po 24 h byly hlízy máčeny na 20 min v silici v dané minimální inhibiční koncentraci a poté se nechaly oschnout. Hlízy byly umístěny zpět do krabice s víkem a inkubovány za daných podmínek - viz preventivní ošetření. Po 7 dnech byly hlízy podélně rozříznuty přes místa poranění a byly pořízeny fotografie hnilobné plochy. Vyhodnocení velikosti hnilobné plochy bylo provedeno pomocí obrazové analýzy programu Assess 2.0 (APS press, USA).

Oplach

Test probíhal totožně jako test máčení, rozdíl byl pouze v délce kontaktu silice s povrchem hlízy. Oplach probíhal po dobu 1 min.

Výsledky

V provedeném laboratorním testu byla zjištěna různá minimální inhibiční koncentrace vybraných silic (tab. 1). Nejnižší MIC byla u silice ze skořicovníku, zatímco nejvyšší byla vyhodnocena u silice z dobromysli.

Účinnost preventivního ošetření silicemi proti Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum - Mezi odrůdami a jednotlivými způsoby ošetření nebyly nalezeny žádné rozdíly v účinnosti (tab. 2, 3) ani při testování při pokojové teplotě, ani při předskladovací teplotě. Účinnost se pohybovala v rozmezí 85–92 % pro pokojovou teplotu a 71–96 % pro teplotu 15 °C.

Účinnost kurativního ošetření silicemi proti Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum - Mezi odrůdami a jednotlivými způsoby ošetření pro dané teplotní podmínky skladování nebyly nalezeny žádné rozdíly v účinnosti (tab. 4). Účinnost se pohybovala v rozmezí 69–95 % pro pokojovou teplotu a 86–95 % pro teplotu 15 °C.

Tab. 1: Minimální inhibiční koncentrace vybraných silic

Tab. 2: Účinnost preventivního ošetření silicemi vzhledem ke kontrole inokula Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum mezi jednotlivými odrůdami hlíz bramboru

Tab. 3: Účinnost preventivního ošetření máčením hlíz bramboru v silici z máty peprné při různé skladovací teplotě

Závěr

Vybrané silice z rostlin prokázaly v testech na hlízách bramboru poměrně vysokou účinnost proti bakterii způsobující měkkou hnilobu hlíz, a to jak při preventivním, tak i při kurativním ošetření. Stabilní účinnost silic byla prokázána také bez ohledu na odrůdu brambor, způsobu aplikace silice a teplotu, při které probíhalo skladování ošetřených hlíz.

Použitá literatura je k dispozici u autorů článku.

Práce byla vypracována se státní podporou Ministerstva zemědělství ČR v rámci projektu NAZV QK21010083 – „Ekologická ochrana konzumních brambor jako zdravé zeleniny proti vybraným půdou a sadbou přenášeným patogenům“. Poděkování patří i M+H Míča&Harašta s.r.o. za poskytnutí silic.

Ing. Barbora Jílková, Ph.D.¹, Ing. Jana Víchová, Ph.D.¹, Marek Jahn¹, Ing. Martin Kmoch, Ph.D.^2
1Mendelova univerzita v Brně, ²Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.